the Peculiar Circumstances Witnessed=目睹之怪現狀

  不同的細菌需要不同的載體才能將DNA運進去進行複製或表現，不然很容易就會被酵素破壞掉，或是無法表現。

載體英文單詞vector ，在基因工程重組DNA技術中將DNA片段（目的基因）轉移至受體細胞的一種能自我複製的DNA分子。三種最常用的載體是細菌質粒、噬菌體和動植物病毒。

載體

　　在基因操作過程中使用載體有兩個目的：一是用它作為運載工具 ，將目的基因轉移到宿主細胞中去 ；二是 利用它在宿主細胞內對目的基因進行大量的複製 (稱為克隆)。現在所用的載體主要有兩類：一類是細菌細胞質的質粒(質體 )，它是一種相對分子品質較小、獨立於染色體DNA之外的環狀DNA(一般有1～200 kb左右，kb為千堿基對)，有的一個細菌中有一個，有的一個細菌中有多個。質粒能通過細菌間的接合由一個細菌向另一個細菌轉移，可以獨立複製，也可整合到細菌染色體  DNA中，隨著染色體DNA的複製而複製。另一類載體是噬菌體或某些病毒等。現在人們還在不斷尋找新的載體，如葉綠體或線粒體DNA等也有可能成為載體。

　　作為載體必須具有四個條件： ①在宿主細胞中能保存下來並能大量複製；②有多個限制酶切點，而且每種酶的切點最好只有一個，如大腸桿菌pBR322就有多種限制酶的單一識別位點，可適於多種限制酶切割的DNA插入；③ 含有複製起始位點，能夠獨立複製；④有一定的標記基因，便於進行篩選。如大腸桿菌的pBR322質粒攜帶氨苄青黴素抗性基因和四環素抗性基因，就可以作為篩選的標記基因。一般來說，天然載體往往不能滿足上述要求，因此需要根據不同的目的和需要，對載體進行人工改建。現在所使用的質粒載體幾乎都是經過改建的。　

　　基因克隆的載體類型：質粒載體，噬菌體載體，柯斯質粒載體，M13噬菌體載體，噬菌粒載體
在基因工程中，常用人工構建的質粒作為載體。人工構建的質粒可以集多種有用的特徵於一體，如含多種單一酶切位點、抗生素耐藥性等。常用的人工質粒運載體有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四環素基因(Tcr)和抗氨苄青黴素基因(Apr)，並含有5種內切酶的單一切點。如果將DNA片段插入EcoRI切點，不會影響兩個抗生素基因的表達。但是如果將DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或 Sal I切點，就會使抗四環素基因失活。這時，含有DNA插入片段的pBR322將使宿主細菌抗氨苄青黴素，但對四環素敏感。沒有DNA插入片段的pBR322會使宿主細菌既抗氨苄青黴素又抗四環素，而沒有pBR322質粒的細菌將對氨苄青黴素和四環素都敏感。pSC101與pBR322相似，只是沒有抗氨苄青黴素基因和PstI切點。質粒運載體的最大插入片段約為10 kb(kb表示為千堿基對)。

　　1973年，科學家將質粒作為基因的載體使用，為基因工程的誕生奠定了基礎。

　　最常用的質粒是大腸桿菌的質粒。這種質粒常含有抗生素抗性基因，例如，卡那黴素抗性基因。

　　pBR322質粒DNA分子的長度為4363bp，此載體中有兩個標記基因，一個是氨苄青黴素抗性基因（Apr），另一個是四環素抗性基因（Tetr）。現在已知pBR322DNA分子共有24種核酸內切限制酶的單一識別位點。其中7種限制酶（從12：00位置按順時針方向）即EcoRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、XmaIII和NruI的識別位點位於四環素抗性基因內部，另

　　外有2 種限制酶即ClaI和HindIII的識別位點是存在于這個基因的啟動區內，在這9個限制位點上插入外源DNA都會導致tetr的失活。3種限制酶即ScaI、PvuI和PstI的識別位點位於氨苄青黴素抗性基因內，在這些位點插入外源DNA則會導致ampr基因的失活。由pBR322質粒載體的結構可知其具有如下優點：（ 1）具有較小的分子量。經驗表明，為了避免在DNA的純化過程中發生鏈的斷裂，克隆載體的分子大小最好不要超過10Kb。pBR322質粒這種小分子量的特點，不僅易於自身DNA的純化，而且可容納較大的外源DNA片段；（2）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇記號，能指示載體或重組 DNA分子是否進入宿主細胞以及外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。標記基因往往可以賦予宿主細胞一種新的表型，這種轉化細胞可明顯地區別於非轉化細胞。當我們把一個DNA片段插入到某一個標記基因內時，該基因就失去了相應的功能。當把這種重組DNA分子轉到宿主細胞後，該基因原來賦予的表型也就消失了。要是仍保留了原來表型的轉化細胞，細胞內含有的DNA分子一定不是重組子。很顯然，既要指示外源DNA是否進入了宿主細胞，又要指示載體DNA分子中是否插入了外源DNA片段，那麼這種載體必須至少具有兩個標記基因。

Ref.

翰林學測新導向, 龍騰生物......